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Jun 27, 2023Jun 27, 2023

Nature Microbiology volume 7, pagine 1376–1389 (2022)Citare questo articolo

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La variante SARS-CoV-2 Omicron ha livelli di trasmissione molto elevati, è resistente alla neutralizzazione da parte di anticorpi monoclonali umani terapeutici autorizzati (mAb) ed è meno sensibile all’immunità mediata dal vaccino. Per fornire terapie aggiuntive contro Omicron, abbiamo isolato un mAb denominato P2G3 da un donatore vaccinato precedentemente infetto e abbiamo dimostrato che ha un’attività neutralizzante nell’intervallo picomolare contro Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2 e tutte le altre varianti testate. Abbiamo risolto la struttura di P2G3 Fab in complesso con il picco di Omicron utilizzando la microscopia crioelettronica con una risoluzione di 3,04 Å per identificare l'epitopo P2G3 come un mAb di Classe 3 che è diverso dagli epitopi di picco leganti mAb riportati in precedenza. Utilizzando un modello di sfida con la scimmia Omicron SARS-CoV-2, dimostriamo che P2G3 da solo, o in combinazione con P5C3 (un mAb di Classe 1 ampiamente attivo precedentemente identificato), conferisce una protezione profilattica o terapeutica completa. Sebbene potessimo selezionare i mutanti SARS-CoV-2 che sfuggono alla neutralizzazione da parte di P2G3 o P5C3 in vitro, avevano una bassa infettività e le mutazioni “di fuga” sono estremamente rare nei database di sequenze pubbliche. Concludiamo che questa combinazione di mAbs ha un potenziale come farmaco anti-Omicron.

SARS-CoV-2 è responsabile di oltre 340 milioni di infezioni confermate e di oltre 5,5 milioni di decessi in tutto il mondo1. La sua propagazione ha portato alla comparsa di varianti preoccupanti (VOC) che sono più trasmissibili e resistenti alle risposte immunitarie. I COV che ospitano un numero elevato di mutazioni rispetto al ceppo SARS-CoV-2 originale predominano, con Delta (B.1.617.2) e le sue 11-15 mutazioni di picco ora in gran parte sostituite dalla variante altamente infettiva Omicron (B.1.1.529.1 ), che contiene fino a 37 mutazioni di aminoacidi nella proteina spike2,3. Quindici delle sostituzioni di picco in Omicron si trovano nel dominio di legame del recettore (RBD), la regione presa di mira dagli anticorpi neutralizzanti (indotti dall'infezione o dai vaccini attuali) che sono stati tutti generati contro il ceppo Wuhan 2019-nCoV originale4,5,6,7 ,8. Omicron resiste inoltre alla neutralizzazione da parte della maggior parte dei mAbs anti-SARS-CoV-2 finora segnalati9,10,11,12,13,14,15 e ora circola in diverse sottovarianti tra cui BA.1.1, BA.2 (B.1.1 .529.2) e BA.3 (B.1.1.529.3)2, creando un bisogno medico urgente e insoddisfatto sia per la profilassi che per la terapia.

Abbiamo effettuato uno screening per la presenza di anticorpi anti-spike nei campioni di siero di una coorte di >100 donatori e ci siamo concentrati su un donatore post-infetto che ha ricevuto due dosi del vaccino mRNA-1273 e presentava livelli di anticorpi sierici tra i più alti, con un'eccellente ampiezza contro un pannello di varianti SARS-CoV-2 in un test di neutralizzazione surrogata trimerica di picco-ACE216. Lo screening dei surnatanti dei cloni di cellule B per il legame dei picchi ad alta affinità ci ha portato a dare la priorità a sei cloni per la produzione di mAb tramite l'espressione di catene pesanti e leggere accoppiate nelle cellule ExpiCHO. Durante la profilazione iniziale di questi mAb purificati, P2G3 ha mostrato la più forte affinità di legame per il trimero di picco 2019-nCoV originale e un pannello di proteine ​​​​di picco che codificano mutazioni trovate nei COV Alpha, Beta, Gamma e Delta (IC50 di 0,006–0,010 µg ml−1 ) (Dati estesi Fig. 1a). Studi cross-competitivi di legame con RBD di picco eseguiti con un pannello di mAb anti-SARS-CoV-2 autorizzati o clinicamente avanzati (REGN10933 e REGN10987 di Regeneron17, AZD8895 e AZD1061 di AstraZeneca18, ADG-2 di Adagio19, S309/Sotrovimab di Vir/GSK20 ) e i mAbs precedentemente descritti dal nostro gruppo21 dimostrano che P2G3 lega un epitopo unico sebbene sovrapposto a quelli riconosciuti sia da AZD1061 che da S309/Sotrovimab, quest'ultimo agendo con un meccanismo distinto dal blocco dell'interazione RBD/ACE220 (Dati estesi Fig. 1b). È importante sottolineare che il nostro potente e ampiamente attivo mAb di Classe 1, P5C3, legava RBD in modo non competitivo con P2G3, spingendoci a profilare questi mAb sia da soli che in combinazione per studi successivi.

42-fold more potent than ADG-2, AZD1061, AZD8895, REGN10933 and REGN10987 mAbs and 19-fold more potent than Sotrovimab at neutralizing Omicron BA.1 spike-pseudotyped lentiviral particles (Fig. 2b). Second most potent was P5C3, with an IC80 value of 0.223 µg ml−1, and the P2G3/P5C3 combination revealed a minor-enhanced activity over P2G3 alone in this assay, with an IC80 value of 0.024 µg ml−1 for the total concentration of the two mAbs. Furthermore, P2G3 and P5C3 maintained full neutralizing activity against the ancestral D614G and Omicron BA.1.1 encoding the R346K spike pseudovirus (Extended Data Fig. 2a,b), a mutation present in ~10% of Omicron variant sequences in the GISAID11./p>10× less potent than P2G3, P5C3 and both the AZD and REGN cocktails against this virus./p>6.2 µg ml−1 at the time of viral inoculation and P2G3 treatment groups showed a significant ~4-log reduction of genomic viral RNA levels (Extended Data Fig. 4c)./p>1,200 Å2 (Fig. 5b and Extended Data Figs. 7a and 8a). To characterize the P2G3 paratope and epitope interface in detail, we performed local refinement of the P2G3 Fab-RBD interacting region and reached a resolution of 3.84 Å with well-defined density, allowing clear interpretation of sidechain positions (Extended Data Figs. 6 and 8, and Supplementary Fig. 2 and Data Table 1). The P2G3 paratope is composed of four complementarity-determining region (CDR) loops binding at the back of the RBD. The interactions are mediated through electrostatic and hydrophobic contacts (Fig. 5c,d and Extended Data Fig. 8b,c) and involve 16 residues of the RBD, mainly bound by the heavy chain of the P2G3 mAb. The 18-residue-long CDRH3 sits at the top of a loop that comprises residues 344–347, and also contacts the amino acids at the limits of the 5-stranded β-sheet (residues 440–451), overall accounting for >60% of the buried surface area (431 Å2) (Extended Data Fig. 8a–c). The interactions between P2G3 and the Omicron RBD are conserved in both RBD-up and RBD-down states (Extended Data Fig. 8c,d). CDRH2 extends the epitope by interacting with R346 that is engaged by residue W53 via a potential cation-pi interaction (Fig. 5d and Extended Data Fig. 8e), an interaction that is probably conserved with the R346K spike substitution (Extended Data Fig. 2a,b). The only potential contact from the light chain derives from the CDRL1 Y32 forming a hydrophobic interaction with V445 of the RBD (Extended Data Fig. 8c). Moreover, P2G3 is only observed to contact RBD amino acid residues and the distance to the nearest atom of the glycan branch is ~10 Å from P2G3. Importantly, the epitope defined by our structural studies rationalizes the potent neutralizing activity of P2G3 against the Omicron variant relative to other Class 3 mAbs. Omicron mutations S371L, N440K, G446S and the minor R346K sub-variant are all situated outside of, adjacent to or have little effect on recognition of the P2G3-binding epitope, whereas two or more of these mutations directly impinge on epitopes recognized by REGN10987, AZD1061 and S309/Sotrovimab (Fig. 5e). Furthermore, P2G3 displays a unique binding orientation on the RBD, with its Fab angling away from most of these Omicron mutations (Fig. 5f). In modelling the observed angles of attack of various Class 3 mAbs, it is possible that REGN10987 only binds to the up-RBD form while AZD1061 binds one up- and one down-RBD form, with steric hindrance blocking the third RBD site on the Omicron spike trimer (Extended Data Fig. 9). In contrast, P2G3 and S309/Sotrovimab probably binds both the up and down forms of Omicron RBD without clashes (Fig. 5g and Extended Data Fig. 9c), a characteristic that may contribute to the largely conserved and high potency of P2G3 across VOCs./p>99% by SDS–PAGE analysis. Biotinylation of spike or RBD proteins was performed using EZ-Link NHS-PEG4-biotin (Life Technologies) with a 3-fold molar excess of reagent following the manufacturer’s protocol. Biotinylated proteins were buffer exchanged with PBS using an Amicon Ultra-0.5 with a 3 kDa molecular weight cut-off. Spike and RBD tetramers were prepared fresh before use and formed by combining biotinylated proteins with PE-conjugated streptavidin (BD Biosciences) at a molar ratio of 4:1./p>100 donors were monitored for levels of IgG antibody binding to the SARS-CoV-2 spike trimer proteins from 2019-nCoV, D614G, Alpha, Beta and Gamma variants in the Luminex bead-based assay./p>1-log reduction in viral RNA and infectious virus anticipated in the lung tissue with an effective therapy that can provide statistically significant differences between treated and untreated animals. These sample size assumptions were confirmed in our statistical analysis. Statistical differences in viral RNA levels and infectivity were evaluated using the Mann-Whitney two-sided tests to compare control and treatment groups./p>

4000 cells analysed per condition. c, d) Antibody dependent cellular phagocytosis assay performed ancestral 2019-nCoV and with Omicron BA.1 variant Spike protein biotinylated and bound to streptavidin coated fluorescent beads. Beads mixed with the indicated antibody concentrations were incubated with the U937 monocyte effector cell line and antibody dependent cellular phagocytosis of the Spike coated beads was evaluated by flow cytometry. Dashed lines correspond to individual antibodies and solid lines indicate combinations of P2G3 and P5C3. Results shown are representative data for three separate experiments with each concentration response tested in duplicates or triplicates. Mean values ± SEM are shown./p>

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